微生物源酶制剂抗菌活性的测定
发布时间：
2022-12-24
食品微生物学检验
微生物源酶制剂抗菌活性的测定GB4789.43-2016
1.培养基和试剂
1.1 胰蛋白胨大豆琼脂(TryptoneSoyAgar,TSA), 胰蛋白胨大豆肉汤(TryptoneSoyBroth,TSB),平板计数琼脂(PlateCountAgar),0.1mol/LHCl,无菌生理盐水,50.0μg/毫升环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)溶液,5.0μg/片环丙沙星纸片
2.试验菌株
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538,大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229,蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC2,环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC4516,化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344,粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。
3.检验程序步骤图
4 操作步骤
4.1 试验菌悬液原液制备
将金黄色葡萄球菌(ATCC6538),大肠埃希氏菌(ATCC11229),蜡样芽孢杆菌(ATCC2),环状芽孢杆菌(ATCC4516),化脓性链球菌(ATCC12344),粘质沙雷菌(ATCC14041)冻存菌株分别接种于盛有5毫升TSB的试管,置36摄氏度±1摄氏度培养18h~24h进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培养液1~2环转种于5毫升TSB肉汤,置36摄氏度±1摄氏度培养18h~24h进行二次传代培养,作为试验菌悬液原液备用。
试验菌悬液原液纯度检测:分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于TSA 平板,36 摄氏度±1 摄氏度培养20h~24h,观察纯度。
4.2 菌悬液原液浓度测定
4.2.1 菌悬液原液稀释
分别取4.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10-4稀释液,金黄色葡萄球菌,大肠埃希氏菌,化脓性链球菌,粘质沙雷菌分别制成10-5稀释液。
4.2.2 培养计数
分别吸取4.2.1中制备好的各菌稀释液1毫升于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至46摄氏度左右(可放置于46摄氏度±1摄氏度的恒温水浴箱中保温)的平板计数琼脂15毫升~20毫升,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,于36摄氏度±1摄氏度培养24h后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于106 CFU/毫升时方可使用。
4.3 检测平板制备
倾注融化并冷却至46摄氏度±1摄氏度的TSA 培养基15毫升于无菌培养皿内,待其凝固后制成TSA 平板,备用。
将4.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46摄氏度±1摄氏度的TSA 培养基按1∶10的比例稀释(其中化脓性链球菌ATCC12344按1∶20的比例稀释),充分混匀后各取10毫升至上述已制备好,于46摄氏度±1摄氏度中保温的TSA 平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。
注:为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46摄氏度±1摄氏度条件下保温平衡10min。
4.4 酶制剂纸片的制备
准确称(移)取1.0g(毫升)酶制剂于9毫升无菌生理盐水中,充分混匀后制成10%的酶制剂溶液。
将无菌纸片放入无菌平皿内,在每张纸片上缓缓滴加100μL10%的酶制剂溶液,使其全部吸收,每种酶制剂样品制备12张纸片。
4.5 贴纸片及培养
将4.4中制备的含待测酶制剂的纸片,含环丙沙星的阳性对照纸片(见A.7)和含100μL无菌生理盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置4.3中制备的检测平板上,每个平板贴2张纸片(2张含待测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片),两纸片圆点的间距大于32毫米,每个标准菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于4摄氏度±0.5 摄氏度冰箱内过夜(12h~16h)。第二天转入36摄氏度±1摄氏度恒温培养箱中培养24h后,测定酶制剂样品,环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑菌圈。
5 抗菌活性结果报告
5.1 结果判定
若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性,即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈(每个抑菌圈直径≥16毫米),且阳性对照环丙沙星纸片对金黄色葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌,粘质沙雷菌,环状芽孢杆菌,化脓性链球菌5种细菌形成的抑菌圈均>16毫米,则判定该酶制剂样品中存在抗菌活性物质。
5.2 结果报告
报告样品中检出抗菌活性或未检出抗菌活性。
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