化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌

发布时间:

2022-12-27

作者:

成品培养基干粉


化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌
 
绿脓杆菌在自然界分布甚广,空气、水、土壤中均有存在.对人有致病力,常引起人皮肤化脓感染
特别是烧伤.烫伤、眼部疾病患者被感染后.常使病情恶化,并可引起敗血定.因此,在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌
 
方法提要
根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌.氧化酶阳性,能产生绿脓蘭素.此外还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42摄氏度条件下生长等,可与类似菌相区别
 
培养基和试剂
SCDLP液体培养基
SCDLP液体培养基图片
见0B7918.1-87《化妆品微生物标准检验方法总则)
十六烷三甲基澳化铵培养基
成分:牛肉青3克,蛋白胨.10克,氯化钠.5克,十六烧三甲基溴化铵.0.3克,琼脂20克,蒸馏水1000毫升
制法:除琼脂外.将上述成分混合加热溶解,调pH为7.4~7.6,加入琼脂.115摄氏度(101)20分钟灭菌后,制成平板备用
 
乙酰胺培养基
成分:
乙酰胺.10.0克,氯化钠5.0克,无水磷酸氯二钾1.39克,无水磷酸二氢钾0.73克,硫酸铁(M克SO,●7H,O)0.5克,酚红0.012克,琼脂20克,蒸馏水1000毫升
制法:除琼脂和酚红外,将其他成分加到蒸儒水中.加热溶解,调pH为7.2,加入琼脂、酚红,121摄氏度
 
(151lb)20分钟高压灭菌后,制成平板备用
 
绿脓菌色素测定用培养基
成分,蛋白胨20克,氯化镇1.4克,硫酸10克,琼脂8克,甘油(化学纯)15克,蒸馏水1000毫升
制法:将蛋白胨、氟化铁和磽酸钾加到蒸馏水中.加温使溶解,调明H至7.4.加入琼脂和甘油,加热溶解,分装于试管内,115摄氏度(101b)20分钟高压灭菌后,制成斜面备用
 
明胶培养基.
 
成分:牛肉青3克,蛋白胨5克,明胶120克,蒸儒水1000毫升
制法,取各成分加在戴儒水中粳泡20分钟,随时搅拌加温使溶解,调叫H至7.4.分装于试管内,经115摄氏度(101b)20分钟灭菌后,直立制成高层备用
 
硝酸盐蛋白胨水培养基
成分:蛋白胨10克,酵母浸膏3克,硝酸钾2克,亚硝酸钠0.5克,蒸馏水1000毫升
制法:将蛋白陈和醇母浸青加到蒸馏水中.加温使溶解,调pH为7.2,煮佛过滤后补足液量,加入硝酸钾和亚硝酸钠.溶解混匀,分装到加有小倒管的试管中,115摄氏度(10Ib)20分钟灭菌后备用
 
普通琼脂斜面培养基
成分:
蛋白胨10克,牛肉青3克,氯化钠5克,琼脂15克,蒸馏水1000
制法:除琼脂外.将其余成分溶解于蒸馏水中,调pH为7.2~7.4.加入琼脂.加热溶解.分装试管,121摄氏度(15Ib)15分钟高压灭菌后.制成斜面备用
 
仪器
培养箱:37摄氏度.42摄氏度,锥形烧瓶,试管,灭菌平皿,灭菌刻度吸管,显微镜,载玻片,接种针、接种环,电炉,商压消毒钢
 
操作步骤
增菌培养:取1:10样品稀释液10毫升加到90毫升SCDLP被体培养基中,置37摄氏度培养18至24小时.如有绿脓杆菌生长,培养液表面多有一层薄菌膜.培养液常呈黄绿色或蓝绿色.
注,如无SCDLP罐体墙养基时.可用普通肉汤培荞基.检验含防腐剂的化妆品时,在每1000毫升普通肉汤中加1克卵磷脂.7克吐温80.
 
分离培养:从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上.置37摄氏度培养18至24小时.凡绿脓杆菌在此培养基上,其菌落扁平无定型,向周边扩散或略有蔓延,表面湿润.菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性色素,此培养基选择性强,大肠艾希氏菌不能生长,革兰氏阳性菌生长较差.
在缺乏十六烧三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平血中,放37摄氏度培养24小时.绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落自平.边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不生长.
染色镜检:挑取可疑的菌落,涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试脸.
氧化酶试验:取-小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻璃槔挑取绿肤杆菌可疑菌落涂在滤纸片.上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液,在15至30s之内,出现粉红色或紫红色时,为氧化酶试验阳性,若培养物不变色.氧化酶试验阴性.
绿脓菌素试验:取可疑菌落2至3个,分别接种在绿脓菌素测定用培养基上,置37摄氏度培养24小时,加入氧仿3至5毫升,充分振荡使培养物中的绿胀麴岽溶解于氧仿液内,待氧仿提取液呈蓝色时,用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1毫升左右,振葛后,静置片刻.如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在.
硝酸盐还原产气试验:挑取被检的纯培养物,按种在硝酸盐胨水培养基中,置37摄氏度培养24小时.观察结果.凡在硝酸盐陈术培养基内的小倒管中有气体者,即为阳性.表明该菌能还原硝酸盐,井将亚硝酸盐分解产生氨气.
明胶液化试验.取绿驗杆菌可疑菌落的纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置37摄氏度培养24小时,取出放冰箱10至30分钟,如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性.如凝固不將者为阴性.
42摄氏度生长试验:挑取纯培养物.接种在普通琼脂斜面培养基上,放在41至42摄氏度培养箱中.培养24至48小时,绿脓杆菌能生长,为用性,而近似的荧光假单胞菌则不能生长.
检验结果报告
被检样晶经增菌分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌.氧化酶及绿脓蘭素试验皆为用性者.即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌.如绿脓的素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42摄氏度生长试验三养皆为阳性时.仍可报告被检样品中有绿脓杆菌.
 
附加说明:
本标准由中国預防医学科学院环境卫生监测所归口.
本标准由“化妆晶微生物标准检验方法"起草小组起草.
本标准主要起草人周淑玉.
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释.