大型真菌菌种保藏的基本原则方法及技术

发布时间:

2022-11-16

作者:

做培养基试剂的厂家日水生物


大型真菌菌种保藏的基本原则方法及技术

范围
本规程规定了大型真菌菌种保藏的基本原则、方法及技术要求.
本规程适用于各类大型真菌菌种的保藏.
 
术语与定义
大型真菌macrofungi
大型真菌是菌物中形成大型子实体的一类真菌,泛指广义上的蘑菇或蕈菌.
程控降温controlledratefreezing
液氮超低温保藏preservationinliquidnitrogen
液氮超低温保藏技术是将菌种在-196的液态氮,或在-150的气态氮中长期保藏的方法,其原理是利用生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物.
 
原理
菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以达到最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制菌丝的生长和繁殖,使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态,从而延长菌种的保藏时间.
 
技术要求
不同菌种应根据要求选择适合的培养基进行培养
接种须无菌操作,避免杂菌污染
定期检查
保藏期间要定期检查保藏菌种的冰箱温度和湿度;检查保藏器皿的棉塞有无生霉现象,如发现异常则立即取出该管重新纯化,经培养后补上空缺;在低倍解剖镜下抽样检查有无螨虫等害虫,发现时须及时消除.
 
方法与步骤
斜面低温保藏法
将要保藏的菌种接种在斜面培养基上,20-30培养,当菌丝长满斜面时取出,置于4冰箱或冰柜中保藏,每隔3-6个月转接1次,具体间隔时间应根据菌种特性确定.
 
保藏设备和材料
冰箱、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、三角瓶、接种针、试管、培养皿、漏斗、烧杯、吸管、琼脂粉等等.
 
斜面的制备
器皿的准备:在斜面制备的过程中要用到的一些玻璃器皿,如试管、培养皿、三角瓶、漏斗等,使用前洗净,并于80烘干备用.
培养基的制备:在烧杯中倒入500毫升水,按配方称取材料,依次加入水中,逐个溶解,最后定容至1L(在加料过程中,先加缓冲化合物,然后是主要元素、微量元素,最后加维生素等).冷却至室温,调pH值.然后将琼脂粉加入煮沸的液体培养基中,不断搅拌至融化为止,最后补足蒸发的水分.
分装:将配好的固体培养基趁热进行分装,装入试管中的培养基不宜超过试管高度的四分之一.在分装过程中,应注意勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染.
灭菌与摆放斜面:将包扎好的培养基灭菌(0.1MPa,30分钟).灭菌完毕后摆放斜面时,斜面长度不得超过试管管长的一半.
无菌检查:将制备好的斜面放入30培养箱中培养3天做无菌检查.
接种:在超净工作台上,用无菌接种针挑取菌丝体连同少量培养基,接种于适宜的无菌新鲜培养基斜面上,在管壁或小瓶外壁上分别贴好标签标明菌株编号(或名称),然后置于适宜温度的培养箱中培养.
培养:培养4-30天后,根据菌落的形态和其它培养特征,判断新培养物是否为原菌种,并注意有无杂菌污染现象.检查无误后,进行保藏.
低温保藏:培养好的斜面于4-6保藏,相对湿度,通常在50%-70%以下.
保藏时间:一般3-6个月.
菌种的转接:将斜面培养物转接到适宜的新鲜斜面上,在适宜的培养条件下进行培养.
菌种的复壮:如果发现菌种有退化现象,应将退化的菌种引入原来的生活环境中使其生长和繁殖,然后再进行纯种分离,例如在宿主体内生长等方法进行复壮.
斜面低温保藏法应注意事项:每次转接时,应仔细核对各菌株的编号、所用培养基等,发现错误立即纠正.
每次转接培养后,应对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录,检查其培养特征,核实无误后,再行存放.
斜面低温保藏的菌种,一般每个菌株应保藏相继的三代培养物,以便对照.
 
液氮超低温保藏法
保藏设备和材料:液氮罐、程控降温仪、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、培养皿、打孔器、安瓿管(圆底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管),10%甘油或5%或10%的二甲基亚砜、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉等.
安瓿管的清洗和消毒:安瓿管(2毫升)使用前先用自来水冲洗,再用蒸馏水漂洗,于80烘箱烘干.将标签放入安瓿管上部,灭菌(0.103MPa,30分钟),备用.
保护剂的配制和灭菌:一般常用甘油或二甲基亚砜作保护剂.将甘油配成10%的溶液,灭菌(0.1MPa,30分钟),备用;或二甲基亚砜配成5%或10%的溶液,过滤灭菌,备用.
菌种的准备:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂或综合马铃薯培养基平板上,20-28下培养,待菌丝长满后,用无菌打孔器从平板上切取大小均匀的小块(直径约5-10mm),转入安瓿管中;或在安瓿管中加1.2-2毫升的琼脂培养基,接种,培养2-10天.最后加1.5毫升保护剂,封口.
冻结:一般冷冻速度控制在以每分钟下降1为好,使样品冻结到-35.
平板图片
目前常用的有三种控温方法
程控降温法:应用电子计算机程序控制降温装置,可以稳定连续降温,能很好地控制降温速率.
分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却,或悬挂于冰的气雾中逐渐降温.一般采用二步控温,先将安瓿管或塑料小管置于-20至-40冰箱中1-2小时,然后取出放入液氮罐中快速冷冻.这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5.
对耐低温的微生物、可以直接放入气态或液态氮中.
保藏:在气相中-150,液相中-196.
保藏时间:一般10年以上.
转接方法:从液氮罐中取出安瓿管,立即放入38-40温水中,快速复苏.为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,待表面干燥后,用已消毒过的剪刀在安瓿管一端敲开或开启塑料小管,将内容物移至适宜的培养基上,并置于适宜温度的培养箱中进行培养.
 
液氮保藏应注意事项
防止冻伤,操作注意安全,戴面罩及皮手套;
安瓿管要用圆底的.若用塑料管一定要拧紧管盖;
运送液氮时一定要用专用特制的容器,绝不可用密闭容器存放或运输液氮,切勿使用保温瓶存放液氮;
注意存放液氮容器的室内通风,防止过量氮气使人窒息;
当从液氮容器取出安瓿管时,要特别小心,防止破裂爆炸;
注意观察液氮容器中液氮的残存量,定期填充液氮.