食品中的微生物及其产物的鉴定

发布时间:

2022-12-24

作者:

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食品中的微生物及其产物的鉴定

显微观测和取样方法

检测食品中微生物总数的方法:
 
活细胞的标准平板计数法(Standardplatecount,SPC)
最近似数测定法(mostprobablenumber,MPN)
 
检测食品中微生物总数的方法:
 
染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数
 
活性和非活性细胞的直接显微计数法
 
传统的SPC方法
 
菌落总数计数法(“活菌”标准方法):
 
意义:判定食品被微生物污染的程度及卫生质量,也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态.
菌落总数:在一定条件下(需氧,温度,时间,pH…)每克(每毫升)食品检验所生长出来的CFU(菌落形成单位).
国标规定:需氧
细菌NA37摄氏度48h
霉菌酵母PDA25至28摄氏度5天
 
测定方法:检测样品的处理→稀释→倾注(涂布)琼脂平板→计数→报告
 
样品采集
 
采样原则:代表性防止污染
采样的种类:大样一整批样品
中样200g
小样分析的样品(检样)25g
 
采样方法:无菌操作采样用具必须无菌尽量采集有包装的食品
 
粉末状样品边取样边混合
液体样品边振摇边混合
冷冻食品保持冷冻状态
非冷冻食品保存在0至5摄氏度
 
采样数量和部位:200g/件
 
乳制品一瓶(个,罐,听)
粮三层五点(表,中,下)
油重点采取表层及底层油
 
采样标签:名称来源数量编号时间
 
送检从采样到实验室越快越好不得超过3小时
 
样品的处理和稀释
 
取样无菌操作25g放入225毫升的无菌瓶内1:10稀释液
均匀混合均质器
稀释
倾注
倾注平板稀释液移入平皿后,将46摄氏度至的营养琼脂培养基注入平皿约15毫升,转动平皿.
 
空白对照
 
倒置培养:琼脂凝固后,翻转平板
细菌37摄氏度48小时
霉菌28摄氏度5天
 
菌落计数法(肉眼观察,放大镜,TTCC(氯化三苯基四氮唑)显色)
 
菌落计数的报告报告单位:cfu/g(毫升)
 
平板菌落数的选择:30至300
 
稀释度的选择:
 
菌落数的报告:100以内时按实数报告
 
大于100时两位有效数字(如:16400→16000)
 
涂布平板法:先倒平板待凝固后,吸取0.1毫升稀释液于平板表面上,用灭菌涂布棒在整个平板上均匀涂布,培养观察涂布法的优缺点:可检测到热敏性菌体;菌落形态比较明显;更适合于严格的好菌;没有倾注法简便,易出现菌落重叠,混杂现象.
 
旋转接种法(Spiralplatemethod)原理:
 
把液态样品螺旋式并不断稀释地接种到一个旋转平皿中的培养基表面.(P179至180)
 
菌落计数的其它方法
 
膜过滤(DEFT),MPN,染色还原计数法,DMC)
 
膜过滤
 
SPC方法的改良过滤膜的孔径=0.45um收集菌体提高检出率直接显微计数
 
膜过滤与荧光染色方法结合
 
直接荧光膜技术计数法(DirectEpifluorescentFilterTechnique,DEFT)快速检测技术:特殊滤膜(0.5um)过滤样品液
 
滤膜经啶橙染色
紫外光显微镜观察
活细胞橙色荧光
死细胞绿色荧光
20至30min
 
DEFT—微菌落计数仅用于活细胞的检测
 
原理:食品匀液经DEFT膜过滤,膜放在培养基表面,恒温培养***微菌落长出,显微镜观察
 
(G-:3h;G+:6h)
 
最近似数测定法(MPN)
 
选择3个稀释梯度的稀释液,每种稀释液接种3管(5管)装有培养基的试管中培养,根据实验结果查MPN检索表,得到样品中微生物数量.(1915年McCrady发明)
 
广泛应用的原因:方法相对简单;与SPC相比,相似率较高;用选择性培养基可检测特殊的微生物类群;测定大肠菌群数量的方法
 
大肠菌群(领域用语与粪便污染有关的细菌)
 
定义:需氧及兼性厌氧,在37摄氏度能分解乳糖产酸产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌.
 
大肠埃希氏菌,柠檬酸杆菌,产气克雷氏菌,阴沟肠杆菌
 
检测大肠菌群的意义
 
粪便污染的指示菌:大肠菌群的高低,表明粪便污染的程度作为肠道致病菌污染食品的指示菌
 
 
染色还原计数法(估算法)
 
原理:活细胞内含有还原酶,可把特定的染料从一种颜色还原为另外一种颜色.
 
亚甲基蓝(兰色)→白色
 
刃天青(暗兰色)→粉红色白色
 
染色还原的时间与样品中微生物浓度成反比
 
优点:简便,快捷和经济原料乳
缺点:不同的微生物还原能力不同,给估算带来了一定的困难.不适用于含有还原酶的食品.
 
 
显微直接计数法(Directmicroscopecount,DMC)
 
方法:一定量的食品(0.001毫升)显微镜载玻片(1cm2)烘干,固定,脱脂,染色,复式显微镜计数,换算
 
优点:快捷,简便;能对细胞形态进行分析;载玻片易保存
缺点:仅适于检含大量菌体的样品;准确性差;易造成操作人员的疲劳
 
 
棉拭子涂抹法表层微生物的检测应用于食品,公共场所方法:
 
无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水(10毫升试管)均匀涂抹样品表面一定面积(5X125px,1X25px)后,放回试管中,及时送检;
试管振荡,使微生物悬浮于稀释液中;
按SPC方法进行梯度稀释,培养,计数
 
代谢受阻的微生物
 
因素:亚致死高温,冷冻,激光,杀虫剂,染料,化学物质
 
受损现象:细胞膜受损TCA中的酶受损核糖体受损DNA被破坏
 
鉴定微生物代谢受损的方法:非选择性培养基与选择性培养基数量差
 
恢复与修复:细胞壁,蛋白质合成
 
保护剂:脱脂牛乳蔗糖非代谢性糖多元醇
 
恢复剂:酸过氧化氢酶
 
机理:降解过氧化氢受损细胞缺少这种能力
 
 
不可生长的活性微生物
 
不可生长的活性细胞(VBNC):弧菌在冬季的盐水中(5摄氏度)细胞的形态由弧状转变成球状并很难培养,这样的细胞称至
 
4摄氏度VBNC状态保持4个月
VBNC状态非选择培养基X
SPC数量少
DMC吖啶橙计数数量高
VBNC状态的转变:温度
创伤弧菌5摄氏度,7d→VBNC21摄氏度,24h→原态
 
肠炎沙门氏菌志贺氏菌霍乱弧菌大肠杆菌可变为VBNC态.
日水平板图片