Ames试验:利用细菌检测基因突变的方法
发布时间：
2022-12-27
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Ames试验:利用细菌检测基因突变的方法
Ames试验 即鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验,是目前检测基因突变最常用方法之一.
原理:利用鼠伤寒沙门氏菌突变株,即组氨酸缺陷型,其原始菌株菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的,这种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株.本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株,其不能合成组氨酸,而必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型(his-).当诱变剂作用于菌株后,在菌株遗传物质的特定位点发生基因回复突变成为野生型(his+),故在缺乏组氨酸的培养基上,只存少数自发回变菌落生长,而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多,从而可判断被药物是否具有致实变性.
材料:菌株,鼠伤寒沙门氏菌TA97,TA98,TA100,TA102.
器材:恒温培养箱,干燥箱,高压消毒锅,水溶锅,紫外线灯(15w),药物天平,分析天平 酒精灯,滤纸片,平皿,试管,烧杯,吸管.
Vogel-Bonner液10×(VB液10倍浓缩)用于配制底层基本培养基.配制方法:硫酸镁(毫克SO4?7H2O)1g,柠檬酸(C6H8O7?H2O)10g,磷酸氢二钾(K2HPO4?3H2O)65.5g,磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4?4H2O)17.5g.将上述成分依次用蒸馏水溶解、混匀,然后加蒸馏水至500毫升,置4摄氏度冰箱保存.
底层基本培养基 取VB液(10倍)100毫升,加入蒸馏水800毫升,用1mol/L NaOH调pH至7.0,然后加入琼脂12—15g,经121摄氏度20分钟高压灭菌.待冷至800C左右时,加入100毫升已经112摄氏度20分钟高压灭菌的20%葡萄糖液,混匀后浇制平板.
上层培养基 D-生物素12.4毫克,L-盐酸组氨酸9.5毫克,NaCl5g,琼脂6g,上述成分依次加热溶解,混合,然后加蒸馏水至1000毫升.分装后经121摄氏度15分钟高压灭菌备用.
方法
药物的剂量选择
对于易溶解的药物,实验最高剂量可采用抑菌浓度下的最大剂量,或以最大溶解度为最高剂量和5毫克/皿为最高剂量,下设5个剂量,(即5000,500,50,5,0.5,0.1μg/皿).溶剂:药物是水溶性,可用灭菌蒸馏水,如非水溶性可选二甲亚砜为溶剂.
平板掺入法
每皿加底层培养20～25毫升,待凝固.取融化并保温于45摄氏度的上层培养基,分装于5毫升试管中,每支试管2毫升,依次加入新鲜菌液0.1毫升, 药物0.1毫升,需加S9时则加入S9混合液0.3毫升,混匀,迅速倒在底层培养基上,使之分布均匀.待上层琼脂凝固后,翻转平板置37摄氏度培养48小时后,观察结果.
结果评价
观察结果时,首先应观察各实验组和阴性对照的背景菌苔的生长情况.在肯定背景菌苔与阴性对照相差不多后,再比较各剂量组的回变菌落数.若回变菌落数的出现有剂量反应关系,回变菌落数大于自发对照的2倍或以上,结果并具有重现性,并有统计学意义的增加,可判断为阳性,反之为阴性.
附录:Ames 试验记录表,实验者可视需要对表加快修改
对所用菌株进行鉴定
组氨酸营养缺陷(his-)鉴定.取两块底层葡萄糖琼脂平板,其中一块加入0.1mol/L L 一组氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1毫升,另一块(对照)只加入生物素.用白金耳先在生物素对照平板上划线,然后再在组氨酸/生物素平板上划线,四种菌株可划在同一平板上.在培养皿底部用标记笔注明每一菌株划痕.翻转平板,37摄氏度培养24~48小时,观察细菌生长情况.对照平板无细菌生长,含组氨酸平板应有细菌生长.
深粗糙突变(rfa)鉴定—结晶紫抑菌试验 加0.1毫升等测菌液于装有2毫升上层培养基(融化后保持在45摄氏度)的试管中,旋摇混匀后倾倒于营养琼脂平板上,倾斜旋转平板使之分布均匀.凝固后,将一灭菌滤纸片放在平板上,于纸片中心滴加1毫克/毫升结晶紫10μl,或先用灭菌滤纸片沾取结晶紫液,再放置平板上.倒置平板,在37摄氏度培养12~24小时如在纸片周围出现明显的抑菌带(约10mm),则表明有rfa突变存在.
uvrB鉴定——紫外线敏感试验 用灭菌拭子拈取测试菌株在营琼脂平板上做平行划线.有R因子的菌株(TA97,TA98,TA100等)划线在另外的平板上.用黑纸遮住无盖平板的一半,另一半在距离33cm处,用一个15W紫外线灯照射,有R因子菌株照射8秒钟.在同一平板上,应用时用切除修复功能的菌株(如TA102)作为对照.平板照射后,在37摄氏度培养1~24小时,具有uvrB缺陷的菌株,只在未经照射的一侧平板上生长.
R因子(pKM101质粒)鉴定—抗氨苄青霉素试验 用10μl左右氨苄青霉素(8毫克/毫升,0.02mol/L NaOH)在营养琼脂平板上划线,同时用等测菌液在同一平板上与氨苄青霉素交叉划线.在同一平板上可鉴定几种菌株,其中包括一种没有R因子的对照菌株(如野生型),用以说明氨苄青霉素的效力.在37摄氏度培养12~24小时,无R因子者在两线交叉处出现抑菌,有R因子者则无抑菌现象.亦可仿照鉴定rfa突变的方法,用浸有氨苄青霉素的滤纸片贴在已接种R因子待测菌株的平板上.若纸片周围无抑菌圈,则表明对氨苄青霉素有抗性,即R因子存在.
pAQ1质粒鉴定——抗四环素试验 方法类似R因子鉴定,四环素浓度为8毫克/毫升,0.02mol/L HCl,用量10μl.
自发回变鉴定 加0.1毫升待测菌液于含有2毫升上层培养基的试管中,混匀后铺倒在底层基本培养基上.37摄氏度培养24小时,计数每皿自发的回变菌落数.
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