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微生物学实验技术——体外抑菌试验

发布时间：

2022-12-27

作者：

无菌检测培养皿

体外抑菌试验

抑菌试验用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验.通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据.主要方法有进行定性测定的扩散法(如抑菌斑试验)和进行定量测定的稀释法(如最低抑菌浓度实验).

1.常量肉汤稀释法

抗菌药物贮存液制备

抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度.溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度.抗菌药物直接购自厂商或相关机构.所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算.例如：需配制100ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液,所用抗生素为粉剂,其药物的有效力为750μg/mg.用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6mg.根据公式计算所需稀释剂用量为：(182.6mg×750μg/ml)/1280μg/ml=107.0ml,然后将182.6mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中.制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5.配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境,保存期不超过6个月.

药敏试验用抗菌药物浓度范围

根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准,药物浓度范围应包含耐药,中介和敏感分界点值,特殊情况例外.

培养基

NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤,pH7.2~7.4.需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好.在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时,应在肉汤中加入2%(W/V)氯化钠,按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤.嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤,肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤.

接种物的制备

有2种方法配制接种物,一是细菌生长方法,用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个,接种于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉汤中,35℃孵育2-6h.增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准,约含1~2×108CFU/ml.二是直接菌落悬液配制法,对某些苛养菌,如流感嗜血杆菌,淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株,推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液.用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用.注意应在15分钟内接种完配制好的接种物,并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养,以检查接种物纯度.

注：在临床微生物学检验中,麦氏比浊法常用于细菌鉴定,药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法,通常认为,如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时,相当于1.5×108细菌数/ml,由于方法本身就是一种估计的方法,所以尽管不同细菌大小差异很大,除了真菌孢子,细菌的差别不大,结果不会有影响.但是,标准比浊管的浓度,是药敏实验结果的影响因素之一.

附：0.5麦氏比浊管配制方法

0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2.2H2O)0.5ml0.36NH2SO4(1%,V/V)99.5ml

将二液混合,置螺口试管中,放室温暗处保存.用前混匀.有效期为6个月.

稀释抗菌药物的制备及菌液接种

取无菌试管(13×100mm)13支,排成一排,除第1管加入1.6mlMH肉汤外,其余每管加入MH肉汤1ml,在第1管加入抗菌药物原液(如1280μg/ml)0.4ml混匀,然后吸取1ml至第2管,混匀后再吸取1ml至第3管,如此连续倍比稀释至第11管,并从第11管中吸取1ml弃去,第12管为不含药物的生长对照.此时各管药物浓度依次为256,128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25μg/ml.然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml,使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml.第1管至第11管药物浓度分别为128,64,32,16,8,4,2,1,05,0.25,0.125μg/ml.

孵育

将接种好的稀释管塞好塞子,置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h.

结果判断与解释

在读取和报告所测试菌株的MIC前,应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好,同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染,质控菌株的MIC值是否处于质控范围.以肉眼观察,药物最低浓度管无细菌生长者,即为受试菌的MIC.甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断,与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC.

根据NCCLS推荐的分界点值标准,判断耐药(resistant,R),敏感(susceptible,S)或中介(intermediate,

I).S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效,禁忌症除外.R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制,或属于具有特定耐药机理(如β-内酰胺酶),所以临床治疗效果不佳.I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度,疗效低于敏感菌.还表示被测菌株可以通过提高剂量(如β-内酰胺类药物)被抑制,或在药物生理性浓集的部位(如尿液)被抑制.另外,中介还作为“缓冲域”,以防止由微小的技术因素失控,所导致较大的错误解释.

2.微量肉汤稀释法

抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法.

MIC板制备

无菌操作,将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第11孔加药液,每孔10μl,第12孔不加药作为生长对照,冰冻干燥后密封,-20℃以下保存备用.

接种物制备

将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液,经MH肉汤1∶1000稀释后,向每孔中加100μl,密封后置35℃普通空气孵箱中,孵育16~20h判断结果.当试验嗜血杆菌属,链球菌属时,孵育时间为20~24h,试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h.此时,第1孔至第11孔药物浓度分别为128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125μg/ml.

结果判断

以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC.当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义.当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时,应记录抑制细菌生长的最高药物浓度.如出现多处跳孔,则不应报告结果,需重复试验.通常对革兰阴性杆菌而言,微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度(1孔或2倍).

琼脂稀释法

琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物,加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中,制成含不同递减浓度抗菌药物的平板,接种受试菌,孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC.本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定,结果可靠,易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力.

培养基制备

使用MH琼脂,按商品说明书进行配制,pH7.2~7.4.淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%(V/V)绵羊血的MH琼脂(当试验磺胺药时,使用溶解的马血).

含药琼脂平板制备

根据实验设计,将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解,并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中,充分混匀倾倒灭菌平皿,琼脂厚度3~4mm.通常按1∶9比例配制药物琼脂平板,根据需要来选择药物浓度范围.配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中,置2~8℃冰箱可贮存5天.

接种物制备与接种

制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液,再1∶10稀释,以多点接种器吸取制备好菌液(约1~2μl)接种于琼脂平板表面,每点菌数约为104CFU,形成直径为5~8mm的菌斑.接种好后置35℃孵育16~20h(甲氧西林耐药葡萄球菌,万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h),观察结果.奈瑟菌属,链球菌属细菌置5%二氧化碳,幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育.

结果判断

将平板置于暗色,无反光物体表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC.在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长,与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度.

如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上,或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象,则应检查培养物纯度或重复试验.

纸片扩散法(K-B法)

纸片扩散法(K-B法)又称琼脂扩散法K-B法药敏试验时接种物配制有两种方法.

第一种是肉汤增菌法(对数生长法),是用接环挑取3-5个细菌菌落入肉汤增菌管中进行增菌4-6小时,然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培养物进行稀释校正使其浓度达到0.5麦氏比浊标准(因为经过增菌培养其培养物浓度一般都高于此标准).

第二种方法是直接菌落法：从孵育18-24小时的非选择性培养基上,挑取3-5菌落,直接用肉汤或盐制成悬液作为接种,然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准.此法是检测苛养菌(如嗜血杆菌,淋病奈瑟菌和链球菌)和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的推荐方法.

将菌制成菌悬液用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液,涂布整个M2H平板表面,反复3次,每次将平板旋转60度,保证涂布均匀,35℃培养后菌落呈半融合状态,否则影响药敏结果.

K-B法指定用M-H琼脂平板,应用直径90cm平皿,在水平的无菌台上倾倒,准确量取高压灭菌后的M2H琼脂液25ml,使之琼脂板厚度为4mm.否则厚度过高,使含药物纸片的药物半球形扩散的体积加大,导致假耐药;反之导致假敏感.

要求纸片直径6.00～6.35mm,每片吸水量约12μl,纸片的药物含量必须与K2B法规定的一致,用前必须做质量鉴定,质量合格方可使用.

纸片的保存尤为重要,一般要求保存在有干燥剂的容器内低温保存,纸片取出后须放室温10min后方可打开,否则空气中的水份冷凝在纸片上易潮解,使药物失效影响药敏试验结果.

E试验(E-test)