微生物菌种保藏原理及步骤
发布时间：
2022-12-27
作者：
干粉培养基品牌
微生物菌种保藏
实验原理
甘油保藏方法；冷冻干燥保藏方法.
实验材料和用具
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌种.0.75%NaCl(生理盐水),甘油,1.5毫升离心管1个/人.
操作步骤
下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做.
斜面传代保藏法
贴标签取各种无菌斜面试管数支,将注有菌株名称和接种日期标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2-3cm处.
斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上,细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞,而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子.
培养细菌37摄氏度恒温培养18-24h,酵母菌于28-30摄氏度培养36-60h,放线菌和丝状真置于28摄氏度培养4-7d.
保藏斜面长好后,可直接放入4摄氏度冰箱保藏.为防止棉塞受潮长杂菌,管口棉花应用牛皮纸包扎,或换上无菌胶塞,亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞.
保藏时间依微生物种类而不同,酵母菌每4-6个月移种一次、霉菌每6个月移种一次、放线菌每3个月移种一次及有芽孢的细菌每2-6个月移种一次,而不产生芽孢的细菌最好每月移种一次.此法的缺点是容易变异,污染杂菌的机会较多.因此不适宜作工业生产菌种的长期保藏.
液体石蜡保藏法
液体石蜡灭菌在250毫升三角瓶这装入100毫升液体石蜡,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,121湿热灭菌30分钟于40摄氏度温箱这放置14d(或置于105-110摄氏度烘箱中1h),或160摄氏度干热灭菌1-2h,以除去石蜡中的水分,备用.
接种培养同斜面传代保藏法.
加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上,加入量以高出斜面顶端约1cm为宜.
保藏棉塞外包牛皮纸(可换成橡皮塞),将试管直立放置于4摄氏度冰箱中保存.
利用这种保藏方法,霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右,酵母菌可保藏1-2年,一般无芽孢细菌可保藏1年左右.以该法保藏时,应对需保藏的菌株预先作试验,可能某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源,还有些对该法敏感,为预防不测,一般保藏菌株2-3年应做一次存活试验.细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜使用该法.
恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种,在试管壁上轻靠几下,尽量使油滴净,再接种于新鲜培养基中培养.由于菌体表面粘有液体石蜡,生长较慢且有粘性,故一般须转接2次才能获得良好菌种.
生理盐水保藏法.取纯氯化钠0.7-0.9克,放入100%毫升蒸馏水中,搅拌均匀分装试管,每管5-10毫升,进行灭菌(1公斤/平方厘米,30分钟),经无菌检查合格后备用,将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天.无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中,塞上无菌橡皮塞,用石蜡涂封,在室温或低温保藏.
沙土保藏法
沙土处理
沙处理：取河沙经40目过筛,去除大颗粒,加10%HCL浸泡(用量以浸没沙面为宜)2-4h (或煮沸30分钟),以去除有机杂质,然后倒去盐酸,用清水冲洗至中性,烘干或晒干,备用.
土处理：取耕作层瘦黄土(不含有机质),加自来水浸泡洗涤数次,直至中性,然后烘干,粉碎,用100目过筛,去除粗颗粒后备用.
装沙土管将沙与土按2﹕1,3﹕1或4﹕1(W／W)比例混合均匀装入试管中(10毫米×100毫米),装置约7cm高,加棉花塞,并外包牛皮纸,121摄氏度湿热灭菌30分钟,然后烘干.
无菌试验每10土管任抽一支,取少许沙土放入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中,在最适的温度下培养2-4d ,确定无菌生长时可使用.若发现有杂菌,经重新灭菌,再作无菌试验,直到合格.
制备菌液用5毫升无菌吸管分别吸取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面上,用接种环轻轻搅动,制成悬液.
加样用1毫升吸取上述菌悬液0.1-0.5毫升加入士管中,用接种环抖匀.加入菌液量以湿润沙土达2／3高度为宜.
干燥将含菌的沙土管放入干燥器中,干燥器内用培养皿P2O5作为干燥剂,可再用真空泵连续抽气3-4h加速干燥.将沙土管轻轻一拍,沙土呈分散状即达到充分干燥.
保藏沙土管可选择下列方法之一来保藏：
保存于干燥器中；
用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；
将沙土管取出,管口用火焰熔封后面入冰箱保存；
将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中,塞上橡皮塞或木塞,再用蜡封口,放入冰箱中或室温下保存.
恢复培养使用时挑少量混有孢子的沙土,接种于斜面培基上,或液体培养基内培养即可,原沙土管仍可继续保藏.
此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌,可保存2年左右.但不能用于保藏营养细胞.
冷冻保藏法
普通冷冻保藏法(-20摄氏度)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内,严格密封后置于冰箱保藏.该法简单易行,但不适宜多数微生物的长期保藏.
超低温冷冻保藏法
离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞,再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞,保存时菌液加量不宜过多,后加入等体积的20%甘油或10%二甲亚砜冷冻保护剂,混匀后分装入指管,于-70摄氏度冰箱保藏.若干细菌和真菌可用该法保藏5年而活力不受影响.取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在35-40摄氏度温水中轻轻振荡使之迅速融解.当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降.
液氮冷冻保藏法
把细胞悬浮于一定分散剂中或将琼脂培养基上培养的菌种直接进行液氮冷冻,后移至液氮(-196摄氏度)或其蒸汽相中(-156摄氏度)
冷冻干燥保藏法
准备安瓿管→制备脱脂牛奶→准备菌种→制备菌液及分装→预冻→真空干燥→封口→恢复培养
冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干和缺氧等),是目前最有效的菌种保藏方法之一.保存时间可达10年以上.
注意事项
从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后,接种环上带有油和菌,故接种环在火焰灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧,以免菌液四溅,引起污染.
真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态,以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢.
熔封安瓿管时注意火焰大小要适中,封口处灼烧要均匀,若火焰过大,封口处易弯斜,冷却后易出现裂缝而造成漏气.
按以下项目列表记录菌种保藏方法和结果.